23_在天然产物、香精香料、食品风味及环境分析等领域中，如何借助 GC/MS对谱库中未收录的完全未知物质进行准确鉴定？

2025-07-03

　　在天然产物、香精香料、食品风味分析、环境及车内空气分析等领域中，GC/MS是定性分析其中挥发性物质的最常用、且最方便手段。在NIST、Wiley等数据库的帮助下，我们可以轻松对GC/MS采集的未知物谱图进行搜库，以确定可能的疑似物，然后再通过标准品对照来最终定性。但如果质谱谱库或数据库本身没有收录的化合物——完全未知物，那要怎么来定性确定呢？

　　传统的鉴定思路是：1）使用高分辨率质谱以获取可能的分子式，结合EI-MS或运行串联质谱（MS/MS）得到碎片，以帮助推断结构。2）制备纯化一定量的化合物，以便通过其他技术（核磁共振、红外光谱等）进行分析。3）或者购买/ 合成可能的化合物，GC/MS进样后通过保留时间匹配和质谱图对照来确定未知物。

　　但这种传统的鉴定方法过于繁琐，而且需要使用到昂贵的高分辨质谱仪，对于大多数只有四极杆GC/MS的用户来说不切实际。

　　今天我们将分享一种全新的、且更为简单且经济的方法，它能在四极杆GC/MS上直接实现对”完全未知物“的结构推测。

　　● 在MassWorks软件中通过PFTBA标样校准后的质谱数据获得精确质量 /谱图准确度，从而得到未知物的分子式。

　　● 进行NIST的 “Hybrid Search”，该检索方法可查找数据库中不存在但相关的化合物，确定化合物的结构。

　　● 利用AI预测的保留指数（NIST AIRI），通过保留指数匹配进行确认或筛选。

GC/MS上的鉴定真正的未知物

　　如图1所示，未知峰13.88min，峰强度很高，提取的质谱图也表现为单一组分的纯净质谱图。我们同时也采集了C9-40的正构烷烃系列混标数据来进行样品数据的保留指数校正，该未知峰的实测保留指数RI=3329.8。

图1：13.88min处的未知峰及其质谱图（Pforile模式下采集）

　　我们将该未知峰的质谱图发送至NIST谱库进行检索，如图2所示，排名第一的候选结果，其正/反检索匹配值分别为763和839，得到的候选结果并不理想，且各个待选结果的保留指数也与谱库收录的保留指数存在非常大的差异，这就表明，NIST检索对该未知峰并不适用。

图2：未知峰13.88min的NIST检索结果并不理想，没有正确的匹配

　　接下来我们将尝试采用新方法对该未知物进行全面的分析。

　　1. GC/MS结合MassWorks软件测定精确分子量/分子式

　　以Profile轮廓模式采集的GC/MS数据，使用MassWorks软件进行校准，可获得良好的质量准确度（约 ±10 mDa），与谱图准确度相结合，可实现几 ppm 的有效质量准确度，并最终得到精确质量和分子式。

　　该未知峰在MassWorks软件中由PFTBA标样校正后得到的精确质量为450.4816，在±20mDa的质量偏差内，设定元素组成为C、H、O、N，CLIPS search的分子式检索共得到五个分子式，借助分子式同位素的谱图准确度（Spectral Accuracy），我们可以确定正确的分子式是第一个分子式，即C31H62O。

图3：未知物的精确质量测定结果和分子式测定结果（左上：分子式结果；右上：精确质量数和C31H62O的同位素匹配度；下：未知物的质谱图和分子离子）

　　2. AIRI预测保留指数

　　确定分子式为C31H62O后，我们在Pubchem数据库中进行分子式检索，尝试找出所有可能的结构。利用Cerno Bioscience 公司开发基于网络的应用程序，预测所有可能结构的保留指数。

　　如图4所示，Pumchem检索分子式，共有57种可能的化合物，将它们的AIRI在实测RI的±30范围进行筛选，剩下四个可能的化合物，但还不能确定到底哪一个正确的化合物。

图4：Pumchem检索分子式得到的所有可能的结构（左）；将AIRI预测的保留指数用实测值±30过滤，剩下四个可能的结构（右）

　　3. NIST Hybrid Search得到结构式

　　在NIST中，我们将检索模式切换为Hybrid Search模式，它可以帮助我们检索出跟未知物结构相似化合物，通过这些相似化合物我们有可能推测或得到未知物的结构式。

　　使用Hybrid Search需满足如下条件：

　　● Hybrid Search可匹配碎片离子和中性丢失。

　　● 通过纳入 “近邻” 化合物来扩展数据库的范围。

　　● 需要数据库中存在相似的化合物。

　　● 必须知道名义分子量，最好还知道分子式。

　　● 质量差异必须局限于分子的单个区域，且分子的碎裂行为为没有显著变化。

　　● Delta Mass 代表数据库中化合物与未知分子之间的差异（修饰）。

图5：Hybrid search结果示例

　　该未知峰在Hybrid Search检索中，我们得到了三个匹配度非常高的直链烷酮化合物，这意味着该未知物与这三个烷酮化合物拥有着类似的分子结构。结合我们在前面已经确定的分子式C31H62O，我们推测该未知物是跟它们有着不同C原子数量的烷酮化合物。

　　其结构式预测如图6左上图所示。而这一分子式结构刚好是Pubchem结果中剩余四个可能的待选之一。该结构的预测AIRI保留指数为3320，与实测保留指数3329.8的差值为9.8。

图6：

　　综合MassWorks测定的精确质量/分子式、基于Pubchem分子式结构检索和AIRI保留指数、Hybrid Search检索结果，我们几乎可以确定该未知物为2-Hentriacontanone，分子式为C31H62O。

　　小结：

　　结合MassWorks软件的精确质量/分子式、保留指数和Hybrid Search检索，是一种在单四极杆 GC/MS 上进行未知物定性分析的简单、快速的方法。

　　对于不适合Hybrid Search的情况：我们仍然可以使用保留指数 + 分子式鉴定来筛选未知化合物潜的潜在候选物。

　　碎片分析也可用于验证鉴定结果（例如使用 NIST MS Interpreter）。

　　为了保证结果的正确性，最终的化合物鉴定还是需要通过合成化合物来进行确证。

　　关于MassWorks 软件

　　MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

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